Studio pilota finalizzato all’impianto delle cellule staminali mesenchimali di midollo osseo ad uso terapeutico in pazienti pediatrici con tetraplegia congenita ed in pazienti adulti con Sclerosi Laterale Amiotrofica
Istituzioni partecipanti:
Clinica Pediatrica-Divisione di Neurochirurgia Infantile Università degli Studi di Torino
Divisione di Neurochirurgia-Neurologia, Ospedale San Giovanni Bosco, Torino
Background clinico-ematologico
La presenza di cellule staminali di tipo non ematopoietico a livello midollare è stata per la prima volta suggerita dalle osservazioni di Cohnheim che risalgono a 130 anni fa (Cohnheim,1867). Nonostante l’ipotesi di Cohnheim non sia stata sostenuta dai lavori dei colleghi nello stesso periodo, a metà degli anni ’70 grazie ai lavori pioneristici di Friedenstein, divenne chiara l’evidenza che il midollo osseo contiene cellule che possono differenziare in fibroblasti così come in altre cellule mesenchimali. Friedenstein faceva aderire le cellule midollari per 4 ore e quindi eliminava le cellule non aderenti. Le rimanenti cellule aderenti, che erano ben poche, formavano dei foci di 2 o 3 cellule e dopo 4 giorni si moltiplicavano rapidamente ed assumevano un aspetto fibroblastoide (Friedenstein et al., 1976).
Grazie a studi successivi negli anni ’80 (Piersma et al., 1983; Mardon et al., 1987) si verificò che le cellule staminali mesenchimali isolate allo stesso modo sono pluripotenti e sono capaci di differenziare in osteoblasti, condroblasti, adipociti e mioblasti (Wakitani et al., 1995).
Pittenger e colleghi hanno dimostrato che le cellule staminali mesenchimali midollari sono in grado di differenziare nelle diverse linee cellulari di tipo mesenchimale: osteoblasti, condrociti, adipociti, miociti, tenociti e cellule stromali (Pittenger et al., 1999).
Il potenziale utilizzo clinico delle MSC è stato ipotizzato in diversi campi. Prockop ha proposto il loro impiego nell’artrite degenerativa per ricostituire le superfici cartilaginee e ne ha proposto l’utilizzo come veicoli per la terapia genica (Prockop, 1997). Inoltre secondo Carlo-Stella le cellule staminali mesenchimali potrebbero essere utilizzate per la rigenerazione del microambiente midollare dopo radio-chemioterapia ad alte dosi, per accelerare il recupero ematologico dopo trapianto di cellule staminali, per accelerare la ricostituzione T e B linfocitaria dopo trapianto di cellule staminali allogeniche, per la produzione compartimentalizzata di fattori di crescita e citochine, per la modulazione della graft versus host disease (GvHD) e per la produzione di proteine (Carlo-Stella, 1999).
I prerequisiti essenziali per l’uso clinico delle cellule staminali mesenchimali (MSC) sono: a) la possibilità di isolare i progenitori mesenchimali e di espanderli ex vivo in condizioni di coltura standardizzate e b) la dimostrazione della trapiantabilità delle MSCs.
Lazarus et al hanno espanso e reinfuso le MSC in pazienti con neoplasie ematologiche in remissione completa. Tutte le cellule infuse avevano caratteristiche comuni: conservavano il fenotipo dei loro progenitori, avevano morfologia allungata fibroblastoide ed erano positive per gli anticorpi anti-SH2,SH3 e SH4. Non sono state osservate reazioni avverse associate all’infusione endovenosa di cellule staminali mesenchimali (assenza di rush cutaneo, di dolore toracico, di cambiamenti cerebrali o di variazioni funzionali d’organo). La cellularità midollare non cambiava significativamente tra il livello basale e l’esame midollare ripetuto a due settimane dall’infusione delle cellule staminali mesenchimali (Lazarus et al., 1995).
Recentemente Koc e colleghi hanno isolato ed espanso le MSC di donne affette da tumore mammario. Le cellule sono state reinfuse per via endovenosa in seguito a chemioterapia ad alte dosi ed insieme alle cellule staminali periferiche autologhe raccolte dopo aferesi. Essi sono riusciti ad infondere le MSC in quantità variabile da 1 a 2.2×106 cellule/Kg, non hanno osservato reazioni avverse o tossicità imputabili all’infusione ed hanno riscontrato un rapido recupero ematologico (Koc et al., 2000).
Horwitz e colleghi hanno utilizzato il trapianto di midollo osseo allogenico per il trattamento dell’osteogenesi imperfetta sfruttando la presenza di MSC midollari. Essi hanno osservato un aumento del contenuto minerale dell’osso grazie alle capacità di queste cellule di differenziare in senso ostoblastico (Horwitz et al., 2001).
Le MSC, inoltre, possono essere indotte a differenziare in vitro in senso neuronale (Sanchez-Ramos et al., 2000; Woodbury et al., 2000). Questa osservazione pone le basi per un potenziale utilizzo clinico di MSC reinfuse localmente a livello di un danno neuronale e successivamente stimolate a differenziare in senso neuronale a livello del microambiente in cui si vengono a trovare.
Nel nostro Laboratorio siamo riusciti ad isolare, espandere e differenziare in vitro cellule staminali mesenchimali midollari seguendo il protocollo di Pittenger et al. (Mareschi et al., 2001)
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La Sclerosi Laterale Amiotrofica
La Sclerosi Laterale Amiotrofica è una malattia degenerativa del sistema nervoso centrale che interessa selettivamente i motoneuroni. La morte progressiva dei motoneuroni si traduce sul piano clinico in una progressiva plegia di tutta la muscolatura spinale e bulbare fino all’ exitus generalmente per insufficienza respiratoria dopo circa 3 anni dall’esordio.
Benché siano stati svolti numerosi studi epidemiologici nessuno di questi ha fornito una chiara e testabile ipotesi patogenetica. Non sono stati identificati ‘clusters’ di maggiore incidenza in nessuna parte del mondo, pertanto nessuna correlazione é stata trovata con fattori sociali o ambientali. Al momento attuale, pertanto, non vi sono terapie in grado di modificare significativamente il decorso della malattia. I trials clinici farmacologici attualmente in corso mirano da un lato a ridurre i danni utilizzando fattori di crescita nervosi e dall’altro a preservare l’integrità residua attraverso l’utilizzo di farmaci ad azione antiossidante peraltro i risultati, soddisfacenti in vitro, sono assai poco confortanti nei pazienti. Un approccio terapeutico risolutivo dovrebbe mirare alla ricostruzione del tessuto nervoso alterato. Ipotizziamo che questo possa venire perseguito mediante trapianto di nuove cellule che possano sostituire quelle morte o danneggiate dalla malattia.
In questi ultimi anni i paesi all’avanguardia nella ricerca biomedica hanno investito in maniera consistente in questo settore considerato estremamente promettente per la terapia delle malattie degenerative e tra queste la Sclerosi Laterale Amiotrofica.
Numerose evidenze sperimentali sull’animale hanno evidenziato la potenzialità delle cellule staminali nel riparare e rigenerare funzionalmente il tessuto nervoso danneggiato, nell’uomo sono state effettuate sperimentazioni con risultati soddisfacenti nelle malattie extrapiramidali e nelle lesioni ischemiche cerebrali ( Rowland LP,2000)
Nel caso della SLA manca un modello sperimentale animale che riproduca la malattia con le stesse caratteristiche dell’uomo ( Bjorklund,2000), esiste un modello di topo transgenico mutato per la SOD1 che sviluppa una forma di amiotrofia spinale. Sono attualmente in corso sperimentazioni su questo modello sperimentale di impianto di cellule staminali apparentemente con buoni risultati, non esistono tuttavia pubblicazioni scientifiche al riguardo.
Riteniamo che la drammaticità della malattia accanto alla mancanza di un modello animale convincente giustifichi l’organizzazione di trials clinici nell’uomo in parallelo a studi sperimentali animali.
OBIETTIVI
1. Definizione della metodica di inoculazione delle cellule staminali nel midollo di un campione selezionato di pazienti affetti da SLA
2. Verifica delle potenzialità di crescita neuronale nell’uomo di cellule mesenchimali prelevate dal midollo osseo del paziente
3. Verifica dei processi di rigenerazione collaterale nei territori denervati dalla malattia
4. Verifica degli effetti funzionali
5. Verifica degli effetti a lungo termine sul decorso della malattia
6. Identificazione degli effetti secondari sia alla metodica di inoculazione sia alla crescita cellulare.
FASI DELLO STUDIO
1. Definizione della metodica di inoculazione e della safety attraverso sperimentazione su animali.
2. Reclutamento dei pazienti
3. Inizialmente verrà effettuato un prelievo di midollo osseo (5-10 ml) in anticoagulante da cui verranno isolate e caratterizzate mediante citofluorimetria le cellule staminali mesenchimali valutando approssimativamente la percentuale di cellule presenti nel midollo del paziente. Quindi, il paziente verrà sottoposto ad espianto di midollo osseo il cui volume sarà valutato in base ai dati ottenuti dal prelievo iniziale
4. Tre ore prima dell’infusione, le cellule verranno osservate al microscopio ottico a contrasto di fase per controllare la normale morfologia ed eventuali segni visibili di contaminazioni batteriche o fungine.
5. Inoculazione delle cellule nelle corna anteriori del midollo cervicale
6. Monitoraggio clinico, neuroradiologico (RMN) e neurofisiologico (EMG) del paziente al II° giorno dopo inoculazione, I°, III°, VI°, IX° e XII° mese.
7. Analisi dei risultati
RISULTATI PREVISTI
Ipotizziamo una migrazione delle cellule mesenchimali inoculate lungo i cordoni laterali del midollo spinale e la loro differenziazione in motoneuroni.
Ipotizziamo inoltre la ricostruzione delle connessioni di tali motoneuroni con la via nervosa periferica e quindi l’attivazione di processi di reinnervazione evidenziabili dapprima a livello subclinico attraverso l’elettromiografia e successivamente con un recupero del trofismo e della forza muscolare.
Ipotizziamo inoltre che si verifichi un rallentamento del decorso della malattia.
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